Detectarea microscopică a malariei, microfilariozelor, tripanosomiozelor, babesiozelor prin metoda frotiu și picatură groasă

Descriere

Informații generale

Test pentru detectarea microscopică cu acuratețe a stadiilor parazitare și a speciilor antroponotice de Plasmodium, identificarea unei infecții cu Babesia / Trypanosoma / a unor genuri și specii de microfilarii pe frotiu și picatură groasă, colorate permanent cu Giemsa.

Acest test are aplicabilitate în diagnosticul morfologic al:

• infecțiilor date de protozoarul intraeritrocitar Plasmodium vivax, ovale, P. malarie, P. falciparum;
• infecțiilor date de filariile cu stadii de evoluție în sânge din genul Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Brugia timori, Loa loa, Mansonella perstans și Mansonella ozzard;
• infecțiilor date de Trypanosoma cruzii / Typanosoma brucei la pacienții simptomatici cu istoric pozitiv de calatorii în zone endemice de risc / nativii din aceste zone de risc;
• infecției zoonotice cu caracter emergent, indusă de Babesia microti la pacientul mușcat de căpușă.

Semnificație clinică:

1. Malaria este o boală cu transmitere vectorială, dobândită în urma ințepăturii unui țânțar hematofag nocturn (femela Anopheles spp.) și este provocată de un protozoar apicomplex din genul Plasmodium. Infecția cu Plasmodium constituie o cauză importantă de morbiditate și mortalitate la nivel mondial (predominant în zonele tropicale-subtropicale și limitat în anumite zone temperate). Malaria este indusă în principal de 4 specii antroponotice de Plasmodium: P. vivax, P. ovale, P. malariae și P. falciparum. Alte specii de Plasmodium, P. knowlesi și secundar, mai rar P. cynomolgi sunt paraziți simieni, care pot fi o sursă importantă de infecție umană, limitată la arealul Asiei de Sud-Est. Diferențierea lui P. falciparum și P. knowlesi de alte specii este importantă, deoarece ambele pot provoca infecții care pun viața în pericol. În plus, P falciparum este de obicei rezistent la mulți agenți antimalarici utilizați în mod obișnuit, cum ar fi clorochina. Identificarea speciilor de P. vivax și P. ovalae are de asemenea relevanță deosebită în aplicarea selectivă a tratamentului specific cu acțiune asupra formelor reziduale intrahepatocitare și implicit evitarea recidivării infecțiilor cu aceste specii. Secundar, malaria are potential de a fi transmisă și prin transfuzii de sânge, transplant de măduvă osoasă hematogenă și congenital (mai ales în cazul infecției cu P. falciparum).
2. Babesioza este o altă boală cu transmitere vectorială, dobândită în urma mușcăturii unei căpușe și este provocată tot de un protozoar apicomplex, Babesia spp. – B. microti împarte același vector cu Borrelia burgdorferi și Anaplasma phagocytophilum, agenții cauzatori ai bolii Lyme și respectiv ai anaplasmozei granulocitare umane. Studii recente sugerează că expunerea la Babesia microti este destul de comună în zonele endemice pentru boala Lyme și anaplasmoză, așa că este prudent să se ia în considerare testarea concomitentă a tuturor celor 3 boli. Mai rar, babesioza poate fi dobândită prin transfuzie de sânge.
3. Tripanosomele sunt protozoare tisulare din categoria hemoflagelatelor, fiind responsabile fie de boala Chagas (Trypanosoma cruzii) cu areal limitat la America Latină Centrală și de Sud, fie de boala somnului (Trypanosoma brucei), întâlnită în Africa subsahariană, predominant centrală. Tripanosomiazele sunt boli tropicale tot cu transmitere vectorială, dobândite fie în urma întepăturii unei muște hematofage (Glossina spp. / musca tze-tze – cazul lui T. brucei ), fie prin dejectele contaminate ale unei ploșnițe hematofag nocturne din familia Reduvidae (Triatoma spp. / „gândacul pupăcios”- cazul lui T. cruzii), care pătrund în organism prin microleziuni cutanate / mucoasă oculară. Riscul de transmitere secundară prin transfuzii de sânge este valabil în cazul ambelor specii de Trypanosoma, dar și prin transplant de organ, congenital și digestiv, exclusiv în cazul infecției cu T. cruzii.

Diagnosticul infecției acute cu T. cruzii și T. brucei  este confirmat cel mai frecvent prin identificarea microscopică a tripomastigoților în sânge. Detecția tripomastigoților de T. brucei subspecia gambiense (întâlnită în Africa Centrală – Vestică) este însă mai dificilă din cauza caracterului redus și fluctuant al paraziților. De asemenea, în infecția cu T. Cruzii, parazitemia scade și este nedetectabilă în aproximativ 90 de zile de la infectare, astfel în infecția cronică frecvent tripomastigoții de T. cruzii nu mai sunt decelabili, diagnosticul infecției cronice cu T. cruzii bazându-se pe detectarea serologică a anticorpilor specifici în serul pacientului.

4. Filariile sunt nematode evoluate, care provoacă o morbiditate umană semnificativă în regiunile tropicale din întreaga lume. Adulții macroscopici trăiesc în gazda umană și produc descendenți microscopici (microfilarii) în sânge sau piele. Microfilariile Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Brugia timori, Loa loa, Mansonella perstans și Mansonella ozzardi sunt stadii parazitare cu evoluție sangvină, în timp ce microfilariile Onchocerca volvulus și Mansonella streptocerca se localizează subcutanat. Transmiterea infecțiilor are loc tot vectorial, prin mușcătura unor insecte hematofage (țânțari – Anopheles, Culex, Aedes, Mansonia; muște negre – Simulium spp.; muște roșii – Chrysops spp.). W. bancrofti și specia Brugia provoacă o afecțiune gravă numită filarioză limfatică. W. bancrofti este întalnit în zonele tropicale, în timp ce speciile de Brugia sunt întâlnite în anumite părți ale Asiei și Asiei de Sud-Est. Loa loa este limitat la Africa, provocând prin viermele adult un angioedem subcutanat migrator, denumit „edem de Calabar” și ocazional o conjuctivită dureroasă. M perstans și M ozzardi induc o formă relativ ușoară de filarioză. Pacienții sunt adesea asimptomatici. M perstans este întâlnit în anumite părți ale Africii și Americii de Sud, în timp ce M. ozzardi este limitat doar la Mexic și America Centrală și de Sud.

Microfilariile acestor viermi pot fi observate pe picăturile groase și frotiurile din sânge, ceea ce permite identificarea lor definitivă. Cu toate acestea, microfilariile pot fi în număr redus și, prin urmare, utilizarea metodelor de concentrare, gen filtrare prin membrana Nucleopore îmbunătățește sensibilitatea de detecție. Amicrofilaremia sangvina cu W. bancrofti sau Brugia este valabila în infecțiile cronice și în reacțiile de hipersensibilitate de tipul „Plămânului tropical” – situație în care o soluție de diagnostic ar constitui-o detectarea serologică a anticorpilor anti-Filaria în serul pacientului.

Proba:

1. Preparate microscopice (frotiu și picătură groasă din sânge capilar, colorate Giemsa), gata preparate. Deoarece nivelurile parazitemie pot fluctua, pot fi necesare mai multe frotiuri pentru a detecta microfilariile / stadiile malarice. Sângele trebuie obținut și examinat la fiecare 8 până la 12 ore timp de 2 până la 3 zile, înainte de a exclude infecția.
2. + /- Sânge venos recoltat pe anticoagulant EDTA, respectând instrucțiunile de prelevare.

Cantitate:

• câte două preparate microscopice din fiecare tip (2 frotiuri și 2 picături groase).

Instrucțiuni de colectare:

1. Lamele trebuie să fie curate și degresate.
2. Frotiurile din sânge trebuie făcute preferabil din sânge proaspăt recoltat (folosind o picătură de sânge capilar sau o picătură de sânge venos). Sângele pe anticoagulant EDTA este în limite – acceptabil.
3. Pregătiți frotiurile din sânge după cum urmează:

3.a. Pregătiți 2 frotiuri – cu ajutorul laturii unei a doua lame de microscop (așezată în unghi de 30 – 40 grade pe prima lamă), etalați pe prima lamă picatura de sânge sub forma unei pelicule subțiri, unistratificate, terminata în „margine de pană”.

3.b. Lăsați frotiul să se usuce complet la aer și apoi fixați-l prin scufundare rapida în alcool metilic absolut sau 95%.

3.c. Lăsați să se usuce la aer după fixare.

4. Pregătiți picăturile groase din sânge după cum urmează:

4.a. Puneți în centrul unei lame 3 picături de sânge sau o picatură mare de dimensiunea aproximativă a unui bănuț – de preferință din sânge capilar obținut prin puncționarea degetului inelar.

4.b. Folosind un colț al celei de-a două lame, omogenizați picătura de la centru spre exterior, prin aproximativ 20 de mișcări circulare, în timp ce aplicați o presiune fermă pentru defibrinarea sângelui pe lamă. Această tehnică permite sângelui să se usuce rapid și să adere bine la lamă. La final, picătura de sânge ar trebui să ocupe aproximativ un sfert din lungimea lamei sau să aibă 1,5 cm² în diametru.

4.c. Nu fixați picătura groasă. Uscați bine la aer (aproximativ 45 de minute).

• 1 ml sânge venos pe EDTA (vacutainer cu dop mov).

Instrucțiuni de colectare:

2.1. Întoarceți tubul de câteva ori pentru a amesteca sângele.

2.2. Nu transferați sângele în alte recipiente, trimiteți specimenul în tubul original.

Condiții de transport: preparatele microscopice se transportă în carcasa de plastic, specială, de transport pentru lame de microscop; sângele venos se transportă în același vacutainer în care s-a făcut recolatarea, la temperatura ambiantă sau în situații excepționale la o temperatură între 2 °C și 8 °C, în container izoterm cu gheață umedă, în raport cu durata transportului.

Interval de transport: preferabil imediat de la recoltare – în maxim 2 ore la temperatura ambiantă; după 2 ore – în maxim 24 de ore de la recoltare, la o temperatură între 2 °C și 8 °C.

Timp de eliberare:  după 1 – 3 zile, în raport cu numărul de solicitări și cu tipul de probe primit (timpul analitic minim 24 de ore).

Interpretare rezultate / valori de referință:

Raportat negativ sau pozitiv:

• Un frotiu pozitiv indică infecția cu speciile identificate de Plasmodium / Babesia sau de filarii cu stadii de evoluție în sânge.

Observații:

Orice examen care nu include și picătura groasă nu poate fi considerat adecvat.

Identificarea speciilor de Plasmodium are utilitate în alegerea unei terapii antimalarice adecvate.

Interval de recoltare

Luni-Vineri: 07:30-11:00