Determinarea ribotipului PCR al unei tulpini de Clostridioides difficile prin PCR ribotipizare

Descriere

Informații generale

Clostridioides difficile (denumit anterior Clostridium difficile) – specie bacteriană strict anaerobă (intolerantă la oxigen) – este considerat, în prezent, principalul agent etiologic al diareei post-antibioterapie și al colitei pseudomembranoase (forma severă).

Infecția cu Clostridioides difficile (ICD) se manifestă, cel mai frecvent, prin: diaree apoasă, sanguinolentă sau cu mucus (≥ 3-4 scaune apoase / zi), febră, dureri abdominale, greață, anorexie.

Formele infecției variază de la cele ușoare, diareice, până la complicații severe (colită pseudomembranoasă, megacolon toxic), uneori soldate cu deces.

Prin capacitatea sa de sporulare, Clostridioides difficile persistă pe suprafețe timp îndelungat – ani sau chiar zeci de ani – sporii fiind rezistenți la condiții neprielnice creșterii și multiplicării bacteriene: prezența oxigenului, absența nutrienților, uscăciunea, temperaturile ridicate, ultravioletele, dezinfectanții alcoolici, acizi etc.

Cel mai frecvent, infecția cu Clostridioides difficile (ICD) este de tip nosocomial – se manifestă în mediul de spital, cei mai vulnerabili fiind pacienții care au urmat timp îndelungat un tratament cu antibiotice de spectru larg (cefalosporine, fluorochinolone, peniciline, carbapeneme, MLSB etc.), ce induc un dezechilibru al microbiotei intestinale. Totuși, în ultimii ani există semnale că infecția este răspândită și în comunitate, prin propagarea unor tulpini hipervirulente, ce au capacitate exacerbată de sporulare.

Transmiterea are loc prin circuit fecal – oral, vectori fiind mâinile sau mănușile de examinare contaminate prin atingerea suprafețelor cu densitate mare de spori (clanțe, întrerupătoare, mobilier, lenjerie de pat, obiecte sanitare, podea etc.). Sporii, vehiculați pe tegumentul mâinilor, pătrund în tractul digestiv, iar acizii biliari stimulează germinarea sporilor, generând celule vegetative care se multiplică rapid și colonizează mucoasa intestinală.

Virulența tulpinilor de C. difficile este generată de toxinele A și B sintetizate de celulele vegetative în intestinul gros. Acționând sinergic, cele două toxine exercită citotoxicitate asupra epiteliului intestinal și îl lezează, inducând principalul simptom – diareea. Unele tulpini de C. difficile produc și un al treilea tip de toxină – toxina binară, cu rol secundar în patogeneză. Există și tulpini nepatogene, incapabile să sintetizeze toxine (genomul acestora nu conține determinanții genetici codificatori). Colonizarea cu astfel de tulpini nu necesită tratament cu antibiotice.

Tratamentul de primă intenție al ICD constă în antibioterapie (fidaxomicină, vancomicină sau metronidazol în cazul indisponibilității primelor două), prescrisă numai de către clinician, în directă concordanță cu severitatea infecției. Este posibil ca formele cele mai ușoare ale infecției, cu vindecare rapidă (24 – 48 de ore), să nu necesite tratament cu antibiotice.

Infecția este considerată vindecată clinic atunci când simptomele, în special cel diareic, se remit, frecvența și consistența scaunelor revenind la normal.

 

Semnificație clinică:

Determinarea ribotipului PCR al unei tulpini de Clostridioides difficile prin PCR ribotipizare este o metodă moleculară, bazată pe PCR, pentru identificarea tipului de tulpină de Clostridioides difficile izolată, numit ribotip PCR. Metoda este utilizată în scop epidemiologic, pentru investigarea unui focar de înfecție, pentru stabilirea tipului dominant într-o zonă geografică sau pentru aprecierea predictivă a virulenței tulpinilor de C. difficile. În prezent, sunt cunoscute peste 800 de ribotipuri PCR, unele dintre ele fiind mai frecvente. Există câteva ribotipuri PCR hipervirulente și larg răspândite. Unul dintre acestea este ribotipul PCR 027, ce se caracterizează printr-un potențial epidemic ridicat prin sporulare rapidă și patogenitate ridicată prin hipersecreție de toxine.

Metoda constă în amplificarea prin PCR a unui segment intergenic spațiator între gena codificatoare pentru ARNr 16S și cea codificatoare pentru ARNr 23S din structura cromozomului C. difficile și analiza computerizată a profilurilor de ampliconi obținute, prin comparare cu profiluri cunoscute (utilizând o librărie de ribotipuri de referință), pentru identificarea ribotipului PCR al tulpinilor de interes.

Limitări:

–           metoda nu servește, propriu-zis, la diagnosticul de laborator al suspiciunii de ICD, furnizând informații de interes epidemiologic;

–           cantitatea de C. difficile toxigenic în probă: în cazul prezenței unor cantități extrem de mici, sub pragul de detecție al metodei, există riscul de a nu se izola tulpina bacteriană de interes;

–           stabilitatea probei biologice (vechimea sau condițiile de păstrare și/sau transport): există riscul degradării tulpinii bacteriene într-o probă de materii fecale păstrată > 3 zile necongelată (-20 ⁰C), sau supusă unor cicluri successive de îngheț – dezgheț.

 

Pregătire pacient:

Se recoltează, în coprorecoltor steril, fără mediu de transport, o probă proaspătă de materii fecale *modificate (de la slab modificată până la diaree apoasă, sanguinolentă) a pacientului cu infecție cu C. difficile confirmată în laborator (test imunocromatografic sau PCR prozitiv pentru C. difficile toxigenic). Proba se recoltează înaintea sau la începutul curei de antibioterapie pentru ICD.

 

(*Probă modificată de materii fecale – criteriu minim de conformitate: proba să ia forma recipientului sau tija unui tampon de recoltare înfipt în materiile fecale să nu ramână verticală.

Nu se recomandă testarea unei probe de materii fecale de consistență normală.)

 

Se recoltează tampoane rectale doar în cazul pacienților cu ileus.

Proba recoltată este menținută la 2 – 8 ⁰C până în momentul transportului și transmisă, de preferat, în aceleași condiții termice, în cel mai scurt timp posibil către laborator. Dacă nu este posibil transportul imediat al probei, aceasta se menține la 2 – 8 ⁰C maxim 3 zile până la transport, sau se congelează.

 

Interval de referință, interpretarea valorilor:

Rezultatul exprimă ribotipul PCR identificat (de ex.: RT00X).

Rezultatul va fi analizat de către clinicieni / epidemiologi.

 

Interval de recoltare

Luni-Vineri: 07:30-11:00