Detectarea Clostridioides difficile toxigen în materii fecale prin PCR

Descriere

Informații generale

Clostridioides difficile (denumit anterior Clostridium difficile) – specie bacteriană strict anaerobă (intolerantă la oxigen) – este considerat, în prezent, principalul agent etiologic al diareei post-antibioterapie și al colitei pseudomembranoase (forma severă).

Infecția cu Clostridioides difficile (ICD) se manifestă, cel mai frecvent, prin: diaree apoasă, sanguinolentă sau cu mucus (≥ 3-4 scaune apoase / zi), febră, dureri abdominale, greață, anorexie.

Formele infecției variază de la cele ușoare, diareice, până la complicații severe (colită pseudomembranoasă, megacolon toxic), uneori soldate cu deces.

Prin capacitatea sa de sporulare, Clostridioides difficile persistă pe suprafețe timp îndelungat – ani sau chiar zeci de ani – sporii fiind rezistenți la condiții neprielnice creșterii și multiplicării bacteriene: prezența oxigenului, absența nutrienților, uscăciunea, temperaturile ridicate, ultravioletele, dezinfectanții alcoolici, acizi etc.

Cel mai frecvent, infecția cu Clostridioides difficile (ICD) este de tip nosocomial – se manifestă în mediul de spital, cei mai vulnerabili fiind pacienții care au urmat timp îndelungat un tratament cu antibiotice de spectru larg (cefalosporine, fluorochinolone, peniciline, carbapeneme, MLSB etc.), ce induc un dezechilibru al microbiotei intestinale. Totuși, în ultimii ani există semnale că infecția este răspândită și în comunitate, prin propagarea unor tulpini hipervirulente, ce au capacitate exacerbată de sporulare.

Transmiterea are loc prin circuit fecal – oral, vectori fiind mâinile sau mănușile de examinare contaminate prin atingerea suprafețelor cu densitate mare de spori (clanțe, întrerupătoare, mobilier, lenjerie de pat, obiecte sanitare, podea etc.). Sporii, vehiculați pe tegumentul mâinilor, pătrund în tractul digestiv, iar acizii biliari stimulează germinarea lor, generând celule vegetative care se multiplică rapid și colonizează mucoasa intestinală.

Virulența tulpinilor de C. difficile este generată de toxinele A și B sintetizate de celulele vegetative în intestinul gros. Acționând sinergic, cele două toxine exercită citotoxicitate asupra epiteliului intestinal și îl lezează, inducând principalul simptom – diareea. Unele tulpini de C. difficile produc și un al treilea tip de toxină – toxina binară, cu rol secundar în patogeneză. Există și tulpini nepatogene, incapabile să sintetizeze toxine (genomul acestora nu conține determinanții genetici codificatori). Colonizarea cu astfel de tulpini nu necesită tratament cu antibiotice.

Tratamentul de primă intenție al ICD constă în antibioterapie (fidaxomicină, vancomicină sau metronidazol în cazul indisponibilității primelor două), prescrisă numai de către clinician, în directă concordanță cu severitatea infecției. Este posibil ca formele cele mai ușoare ale infecției, cu vindecare rapidă (24 – 48 de ore), să nu necesite tratament cu antibiotice.

Infecția este considerată vindecată clinic atunci când simptomele, în special cel diareic, se remit, frecvența și consistența scaunelor revenind la normal.

 

Semnificație clinică:

Detectarea Clostridioides difficile toxigen în materii fecale prin PCR este o metodă calitativă, înalt sensibilă, de confirmare a prezenței unei tulpini toxigenice de Clostridioides difficile în proba de materii fecale a unui pacient cu suspiciune de ICD.

Metoda constă în detectarea directă a locusului de patogenitate PaLoc al tulpinilor toxigenice de C. difficile (locus codificator pentru toxinele A și B) în probă, prin tehnologia Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP).

Limitări:

–           metoda nu distinge microorganismul viabil de cel non-viabil; de aceea, se recomandă asocierea metodei cu alte tehnici de diagnostic și integrarea rezultatului în contextul clinic al pacientului;

–           cantitatea de C. difficile toxigenic în probă: în cazul prezenței unor cantități extrem de mici, sub pragul de detecție al metodei, există riscul obținerii unui rezultat fals negativ;

–           stabilitatea probei biologice (vechimea sau condițiile de păstrare și/sau transport): există riscul degradării materialului genetic al patogenului într-o probă menținută timp îndelungat la temperatură necorespunzătoare.

Retestarea „de control” la scurt timp după întreruperea tratamentului cu antibiotice nu este recomandată în cazul pacienților vindecați clinic (portajul asimptomatic poate să persiste timp îndelungat, chiar și pâna la 4-6 luni, până la refacerea treptată a microbiotei intestinale protective). Totodată, metoda moleculară poate detecta urme de ADN bacterian non-viabil.

 

Pregătire pacient:

Se recoltează o probă proaspătă de materii fecale *modificate (de la slab modificată până la diaree apoasă, sanguinolentă):

–           în coprorecoltor steril, fără mediu de transport (păstrare în mod excepțional maxim 24 de ore la temperatura ambientală de 21-25⁰C sau maxim 3 zile la 2 – 8 ⁰C);

–           în coprorecoltor steril, cu mediu de transport Cary Blair (păstrare maxim 3 zile la 2 – 8 ⁰C).

(*Probă modificată de materii fecale – criteriu minim de conformitate: proba să ia forma recipientului sau tija unui tampon de recoltare înfipt în materiile fecale să nu ramână verticală.

Nu se recomandă testarea unei probe de materii fecale de consistență normală.)

Se recoltează tampoane rectale doar în cazul pacienților cu ileus.

Proba recoltată este menținută la 2-8 ⁰C până în momentul transportului și transmisă, de preferat, în aceleași condiții termice, în cel mai scurt timp posibil, către laborator. Nu se recomandă testarea unei probe mai vechi de trei zile (risc de degradare a materialului genetic investigat).

În cazul pacienților pediatrici, se recomandă testarea celor cu vârste ≥ 2 ani. Testarea unui pacient cu vârstă < 2 ani trebuie realizată doar la recomandarea medicului, analizându-se temeinic întregul context clinic.

 

Interval de referință, interpretarea valorilor:

Rezultatele se exprimă calitativ: negativ / pozitiv.

Valoare de referință: NEGATIV.

• NEGATIV = – absența Clostridioides difficile toxigenic în proba de materii fecale testată;
• POZITIV = prezența Clostridioides difficile toxigenic în proba de materii fecale testată (prezența PaLoc).

Rezultatul analizei se interpretează obligatoriu în context clinic.

 

Interval de recoltare

Luni-Vineri: 07:30-11:00